ফ্লুরোসেন্স ফিল্টার ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের একটি অপরিহার্য উপাদান। একটি সাধারণ সিস্টেমে তিনটি মৌলিক ফিল্টার থাকে: একটি উত্তেজনা ফিল্টার, একটি নির্গমন ফিল্টার এবং একটি ডাইক্রোয়িক মিরর। এগুলি সাধারণত একটি ঘনক্ষেত্রে প্যাকেজ করা হয় যাতে গ্রুপটিকে মাইক্রোস্কোপে একসাথে ঢোকানো হয়।
কিভাবে একটি ফ্লুরোসেন্স ফিল্টার কাজ করে?
উত্তেজনা ফিল্টার
উত্তেজনা ফিল্টার একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো প্রেরণ করে এবং অন্যান্য তরঙ্গদৈর্ঘ্যকে ব্লক করে। ফিল্টার টিউন করে শুধুমাত্র একটি রঙের মাধ্যমে বিভিন্ন রং তৈরি করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। উত্তেজনা ফিল্টার দুটি প্রধান প্রকারে আসে - লং পাস ফিল্টার এবং ব্যান্ড পাস ফিল্টার। এক্সাইটার হল সাধারণত একটি ব্যান্ডপাস ফিল্টার যেটি শুধুমাত্র ফ্লুরোফোর দ্বারা শোষিত তরঙ্গদৈর্ঘ্যকে অতিক্রম করে, এইভাবে ফ্লুরোসেন্সের অন্যান্য উত্সের উত্তেজনা হ্রাস করে এবং ফ্লুরোসেন্স নির্গমন ব্যান্ডে উত্তেজনা আলোকে অবরুদ্ধ করে। চিত্রে নীল রেখা দ্বারা দেখানো হয়েছে, BP হল 460-495, যার মানে হল এটি শুধুমাত্র 460-495nm ফ্লুরোসেন্সের মধ্য দিয়ে যেতে পারে।
এটি একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের আলোকসজ্জা পথের মধ্যে স্থাপন করা হয় এবং ফ্লুরোফোর উত্তেজনা পরিসর ছাড়া আলোর উত্সের সমস্ত তরঙ্গদৈর্ঘ্য ফিল্টার করে। ফিল্টার ন্যূনতম ট্রান্সমিশন চিত্রের উজ্জ্বলতা এবং উজ্জ্বলতা নির্দেশ করে। যেকোনো উত্তেজনা ফিল্টারের জন্য ন্যূনতম 40% ট্রান্সমিশন সুপারিশ করা হয় যাতে ট্রান্সমিশন আদর্শভাবে 85% হয়। উত্তেজনা ফিল্টারের ব্যান্ডউইথ সম্পূর্ণরূপে ফ্লুরোফোর উত্তেজনা সীমার মধ্যে হওয়া উচিত যাতে ফিল্টারের কেন্দ্র তরঙ্গদৈর্ঘ্য (CWL) ফ্লুরোফোরের সর্বোচ্চ উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্যের যতটা সম্ভব কাছাকাছি থাকে। উত্তেজনা ফিল্টার অপটিক্যাল ঘনত্ব (OD) ব্যাকগ্রাউন্ড ইমেজ অন্ধকার নির্দেশ করে; OD হল একটি পরিমাপ যে একটি ফিল্টার ট্রান্সমিশন রেঞ্জ বা ব্যান্ডউইথের বাইরে তরঙ্গদৈর্ঘ্যকে কতটা ভালোভাবে ব্লক করে। একটি সর্বনিম্ন 3.0 OD সুপারিশ করা হয় কিন্তু 6.0 বা তার বেশি একটি OD আদর্শ।
নির্গমন ফিল্টার
নির্গমন ফিল্টারগুলি নমুনা থেকে পছন্দসই ফ্লুরোসেন্স ডিটেক্টরে পৌঁছানোর অনুমতি দেওয়ার উদ্দেশ্যে পরিবেশন করে। এগুলি ছোট তরঙ্গদৈর্ঘ্যকে অবরুদ্ধ করে এবং দীর্ঘতর তরঙ্গদৈর্ঘ্যের জন্য উচ্চ সংক্রমণ থাকে। ফিল্টার প্রকারটি একটি সংখ্যার সাথেও যুক্ত, যেমন চিত্রে BA510IF (হস্তক্ষেপ বাধা ফিল্টার), এই পদবীটি তার সর্বাধিক সংক্রমণের 50% তরঙ্গদৈর্ঘ্যকে নির্দেশ করে।
উত্তেজনা ফিল্টারগুলির জন্য একই সুপারিশগুলি নির্গমন ফিল্টারের জন্য সত্য: ন্যূনতম ট্রান্সমিশন, ব্যান্ডউইথ, OD, এবং CWL৷ আদর্শ CWL, ন্যূনতম ট্রান্সমিশন, এবং OD সংমিশ্রণ সহ একটি নির্গমন ফিল্টার গভীরতম সম্ভাব্য ব্লকিং সহ উজ্জ্বল সম্ভাব্য চিত্রগুলি সরবরাহ করে এবং সবচেয়ে কম নির্গমন সংকেত সনাক্তকরণ নিশ্চিত করে।
ডাইক্রোইক মিরর
ডিক্রোইক মিররটি উত্তেজনা ফিল্টার এবং নির্গমন ফিল্টারের মধ্যে একটি 45° কোণে স্থাপন করা হয় এবং ডিটেক্টরের দিকে নির্গমন সংকেত প্রেরণ করার সময় ফ্লুরোফোরের দিকে উত্তেজনা সংকেত প্রতিফলিত করে। আদর্শ ডাইক্রোইক ফিল্টার এবং বিম স্প্লিটারগুলির সর্বাধিক প্রতিফলন এবং সর্বাধিক ট্রান্সমিশনের মধ্যে তীক্ষ্ণ রূপান্তর রয়েছে, উত্তেজনা ফিল্টারের ব্যান্ডউইথের জন্য >95% প্রতিফলন এবং নির্গমন ফিল্টারের ব্যান্ডউইথের জন্য 90% ট্রান্সমিশন সহ। ফ্লুরোফোরের ছেদ তরঙ্গদৈর্ঘ্য (λ) মাথায় রেখে ফিল্টারটি নির্বাচন করুন, যাতে বিপথগামী আলো কম হয় এবং ফ্লুরোসেন্ট ইমেজ সিগন্যাল-টু-নোইজ রেশিও সর্বাধিক হয়।
এই চিত্রের ডাইক্রোয়িক আয়নাটি হল DM505, তাই নামকরণ করা হয়েছে কারণ 505 ন্যানোমিটার হল এই আয়নার সর্বাধিক সংক্রমণের 50% তরঙ্গদৈর্ঘ্য। এই আয়নার জন্য ট্রান্সমিশন বক্ররেখা 505 এনএম এর উপরে উচ্চ ট্রান্সমিশন দেখায়, 505 ন্যানোমিটারের বাম দিকে ট্রান্সমিশনে একটি খাড়া ড্রপ এবং 505 ন্যানোমিটারের বাম দিকে সর্বাধিক প্রতিফলন দেখায় তবে এখনও 505 এনএম এর নীচে কিছু সংক্রমণ থাকতে পারে।
লং পাস এবং ব্যান্ড পাস ফিল্টারগুলির মধ্যে পার্থক্য কী?
ফ্লুরোসেন্স ফিল্টার দুটি প্রকারে ভাগ করা যায়: লং পাস (এলপি) এবং ব্যান্ড পাস (বিপি)।
লং পাস ফিল্টারগুলি দীর্ঘ তরঙ্গদৈর্ঘ্য প্রেরণ করে এবং ছোটগুলিকে ব্লক করে। কাট-অন তরঙ্গদৈর্ঘ্য হল পিক ট্রান্সমিশনের 50% মান, এবং কাট-অনের উপরে সমস্ত তরঙ্গদৈর্ঘ্য লং পাস ফিল্টার দ্বারা প্রেরণ করা হয়। এগুলি প্রায়শই ডাইক্রোয়িক আয়না এবং নির্গমন ফিল্টারগুলিতে ব্যবহার করা হয়। লংপাস ফিল্টারগুলি ব্যবহার করা উচিত যখন অ্যাপ্লিকেশনের জন্য সর্বাধিক নির্গমন সংগ্রহের প্রয়োজন হয় এবং যখন বর্ণালী বৈষম্য পছন্দসই বা প্রয়োজনীয় নয়, যা সাধারণত এমন প্রোবের ক্ষেত্রে হয় যা তুলনামূলকভাবে নিম্ন স্তরের পটভূমি অটোফ্লোরোসেন্স সহ নমুনাগুলিতে একটি একক নির্গত প্রজাতি তৈরি করে।
ব্যান্ড পাস ফিল্টার শুধুমাত্র একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্য ব্যান্ড প্রেরণ, এবং অন্য ব্লক. তারা ফ্লুরোফোর নির্গমন স্পেকট্রামের সবচেয়ে শক্তিশালী অংশকে প্রেরণ করার অনুমতি দিয়ে ক্রসস্টালকে হ্রাস করে, অটোফ্লোরেসেন্স নয়েজ কমায় এবং এইভাবে উচ্চ পটভূমির অটোফ্লোরেসেন্স নমুনাগুলিতে সংকেত-টু-শব্দ অনুপাত উন্নত করে, যা দীর্ঘ পাস ফিল্টার অফার করতে পারে না।
বেস্টস্কোপ কত ধরনের ফ্লুরোসেন্স ফিল্টার সেট সরবরাহ করতে পারে?
কিছু সাধারণ ধরণের ফিল্টারগুলির মধ্যে রয়েছে নীল, সবুজ এবং অতিবেগুনী ফিল্টার। টেবিলে দেখানো হয়েছে।
| ফিল্টার সেট | উত্তেজনা ফিল্টার | ডাইক্রোইক মিরর | ব্যারিয়ার ফিল্টার | LED বাতি তরঙ্গ দৈর্ঘ্য | আবেদন |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | · FITC: ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি পদ্ধতি অ্যাসিডিন কমলা: ডিএনএ, আরএনএ · অরামিন: টিউবারকল ব্যাসিলাস ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | · রোডামিন, TRITC: ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি পদ্ধতি প্রপিডিয়াম আয়োডাইড: ডিএনএ · আরএফপি |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | · অটো-ফ্লুরোসেন্স পর্যবেক্ষণ · ডিএপিআই: ডিএনএ স্টেনিং হোচেস্ট 332528, 33342: ক্রোমোজোম দাগের জন্য ব্যবহৃত |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | · ক্যাটেকোলামাইনস · 5-হাইড্রক্সি ট্রিপটামিন · টেট্রাসাইক্লিন: কঙ্কাল, দাঁত |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | · Cy5 আলেক্সা ফ্লুর 633, অ্যালেক্সা ফ্লোর 647 |
ফ্লুরোসেন্স অধিগ্রহণে ব্যবহৃত ফিল্টার সেটগুলি ফ্লুরোসেন্স অ্যাপ্লিকেশনগুলিতে ব্যবহৃত প্রধান তরঙ্গদৈর্ঘ্যের চারপাশে ডিজাইন করা হয়েছে, যা সর্বাধিক ব্যবহৃত ফ্লুরোফোরের চারপাশে ভিত্তি করে। এই কারণে, তারা ফ্লুরোফোরের নামেও নামকরণ করা হয়েছে যেগুলি ইমেজ করার উদ্দেশ্যে করা হয়েছে, যেমন DAPI (নীল), FITC (সবুজ) বা TRITC (লাল) ফিল্টার কিউব।
| ফিল্টার সেট | উত্তেজনা ফিল্টার | ডাইক্রোইক মিরর | ব্যারিয়ার ফিল্টার | LED বাতি তরঙ্গ দৈর্ঘ্য |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| ডিএপিআই | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| টেক্সাস রেড | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
আপনি কিভাবে একটি ফ্লুরোসেন্স ফিল্টার চয়ন করবেন?
1. ফ্লুরোসেন্স ফিল্টার নির্বাচন করার নীতি হল ফ্লুরোসেন্স/নির্গমন আলোকে যতদূর সম্ভব ইমেজিং শেষের মধ্য দিয়ে যেতে দেওয়া এবং একই সময়ে উত্তেজনা আলোকে সম্পূর্ণরূপে ব্লক করা, যাতে সর্বোচ্চ সংকেত-টু-শব্দ অনুপাত পাওয়া যায়। বিশেষ করে মাল্টিফোটন উত্তেজনা এবং মোট অভ্যন্তরীণ প্রতিফলন মাইক্রোস্কোপের প্রয়োগের জন্য, দুর্বল শব্দটি ইমেজিং প্রভাবে বড় হস্তক্ষেপের কারণ হবে, তাই সংকেত থেকে শব্দ অনুপাতের প্রয়োজন বেশি।
2. ফ্লুরোফোরের উত্তেজনা এবং নির্গমন বর্ণালী জানুন। একটি ফ্লুরোসেন্স ফিল্টার সেট তৈরি করতে যা একটি কালো ব্যাকগ্রাউন্ড সহ একটি উচ্চ-মানের, উচ্চ-কন্ট্রাস্ট চিত্র তৈরি করে, উত্তেজনা এবং নির্গমন ফিল্টারগুলিকে ফ্লুরোফোর উত্তেজনার শিখর বা নির্গমনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ অঞ্চলগুলিতে ন্যূনতম পাসব্যান্ড রিপল সহ উচ্চ সংক্রমণ অর্জন করা উচিত।
3. ফ্লুরোসেন্স ফিল্টারগুলির স্থায়িত্ব বিবেচনা করুন। এই ফিল্টারগুলি অবশ্যই তীব্র আলোর উত্সগুলির জন্য দুর্ভেদ্য হতে হবে যা অতিবেগুনী (UV) আলো তৈরি করে যা "বার্নআউট" হতে পারে, বিশেষত এক্সাইটার ফিল্টার কারণ এটি আলোকসজ্জার উত্সের সম্পূর্ণ তীব্রতার অধীন।
বিভিন্ন ফ্লুরোসেন্ট নমুনা ইমেজ
সংস্থানগুলি ইন্টারনেটে সংগৃহীত এবং সংগঠিত হয় এবং শুধুমাত্র শেখার এবং যোগাযোগের জন্য ব্যবহার করা হয়। কোন লঙ্ঘন আছে, মুছে ফেলার জন্য আমাদের সাথে যোগাযোগ করুন.
পোস্টের সময়: ডিসেম্বর-০৯-২০২২